Mycoplasma laboratorium

Mycoplasma laboratorium ou Synthia refere-se a uma espécie sintética de bactéria. O projeto para construir a nova bactéria evoluiu desde o seu início. Inicialmente, o objetivo era identificar um conjunto mínimo de genes necessários para sustentar a vida a partir do genoma de Mycoplasma genitalium e reconstruir esses genes sinteticamente para criar um "novo" organismo. O Mycoplasma genitalium foi originalmente escolhido como base para este projeto porque, na época, possuía o menor número de genes de todos os organismos analisados. Mais tarde, o foco mudou para Mycoplasma mycoides e adotou uma abordagem mais de tentativa e erro.

Para identificar os genes mínimos necessários para a vida, cada um dos 482 genes de M. genitalium foi excluído individualmente e a viabilidade dos mutantes resultantes foi testada. Isso resultou na identificação de um conjunto mínimo de 382 genes que teoricamente deveriam representar um genoma mínimo. Em 2008, o conjunto completo de genes de M. genitalium foi construído em laboratório com marcas d'água adicionadas para identificar os genes como sintéticos. No entanto, o M. genitalium cresce extremamente lentamente e o M. mycoides foi escolhido como o novo foco para acelerar experimentos com o objetivo de determinar o conjunto de genes realmente necessários para o crescimento.

Em 2010, o genoma completo de M. mycoides foi sintetizado com sucesso a partir de um registro de computador e transplantado para uma célula existente de Mycoplasma capricolum que teve seu DNA removido. Estima-se que o genoma sintético usado para este projeto tenha custado US$ 40 milhões e 200 homens-ano para produzir. A nova bactéria conseguiu crescer e recebeu o nome de JCVI-syn1.0, ou Synthia. Após experimentação adicional para identificar um conjunto menor de genes que poderiam produzir um organismo funcional, foi produzido o JCVI-syn3.0, contendo 473 genes. 149 desses genes são de função desconhecida. Como o genoma do JCVI-syn3.0 é novo, é considerado o primeiro organismo verdadeiramente sintético.

Projeto Genoma Mínimo

A produção de Synthia é um esforço em biologia sintética no J. Craig Venter Institute por uma equipe de aproximadamente 20 cientistas liderados pelo ganhador do Nobel Hamilton Smith e incluindo o pesquisador de DNA Craig Venter e o microbiologista Clyde A. Hutchison III. O objetivo geral é reduzir um organismo vivo a seus elementos essenciais e, assim, entender o que é necessário para construir um novo organismo a partir do zero. O foco inicial foi a bactéria M. genitalium, um parasita intracelular obrigatório cujo genoma consiste em 482 genes compreendendo 582.970 pares de bases, dispostos em um cromossomo circular (no momento em que o projeto começou, este era o menor genoma de qualquer organismo natural conhecido que pode ser cultivado em cultura livre). Eles usaram a mutagênese do transposão para identificar genes que não eram essenciais para o crescimento do organismo, resultando em um conjunto mínimo de 382 genes. Esse esforço foi conhecido como Projeto Genoma Mínimo.

Escolha do organismo

Mycoplasma

Mycoplasma é um gênero de bactérias da classe Mollicutes na divisão Tenericutes, caracterizada pela falta de uma parede celular (tornando-a Gram-negativa) devido ao seu estilo de vida parasitário ou comensal. Na biologia molecular, o gênero recebeu muita atenção, por ser um contaminante notoriamente difícil de erradicar em culturas de células de mamíferos (é imune a beta-lactâmicos e outros antibióticos), e por seus usos potenciais como um organismo modelo devido ao seu pequeno tamanho do genoma. A escolha do gênero para o projeto Synthia data de 2000, quando Karl Reich cunhou a frase Mycoplasma laboratorium.

Outros organismos com pequenos genomas

A partir de 2005, Pelagibacter ubique (uma α-proteobactéria da ordem Rickettsiales ) possui o menor genoma conhecido (1.308.759 pares de bases) de qualquer organismo de vida livre e é uma das menores células auto-replicantes conhecidas. É possivelmente a bactéria mais numerosa do mundo (talvez 10²⁸ células individuais) e, juntamente com outros membros do clado SAR11, calcula-se que compõem entre um quarto e meio de todas as células bacterianas ou archaeais no oceano. Foi identificado em 2002 por sequências de rRNA e foi totalmente sequenciado em 2005. É extremamente difícil cultivar espécies que não atingem uma alta densidade de crescimento na cultura de laboratório. Várias espécies recém-descobertas têm menos genes que M. genitalium, mas não são de vida livre: muitos genes essenciais que faltam em Hodgkinia cicadicola, Sulcia muelleri, Baumannia cicadellinicola (simbiontes de cigarras) e Carsonella ruddi (simbionte de hackberry pecíolo gall psyllid, Pachypsylla venusta) pode ser codificada no núcleo hospedeiro. O organismo com o menor conjunto conhecido de genes a partir de 2013 é Nasuia deltocephalinicola, um simbionte obrigatório. Possui apenas 137 genes e um tamanho de genoma de 112 kb.

Técnicas

Várias técnicas de laboratório tiveram que ser desenvolvidas ou adaptadas para o projeto, uma vez que exigia síntese e manipulação de pedaços muito grandes de DNA.

Transplante de genoma bacteriano

Em 2007, a equipe de Venter relatou que eles conseguiram transferir o cromossomo da espécie Mycoplasma mycoides para Mycoplasma capricolum por:

• isolamento do genoma de M. mycoides : lise suave de células aprisionadas em ágar - ágar fundido misturado com células e deixado para formar um gel - seguido de eletroforese em gel de campo de pulso e a banda do tamanho correto (1,25 Mpb circular) sendo isolada;
• tornar competentes as células receptoras de M. capricolum : o crescimento em meios ricos seguiu a fome em meios pobres, onde a fome de nucleotídeos resulta na inibição da replicação do DNA e na alteração da morfologia; e
• transformação mediada por polietilenoglicol do cromossomo circular em células livres de DNA, seguida de seleção.

O termo transformação é usado para se referir à inserção de um vetor em uma célula bacteriana (por eletroporação ou choque elétrico). Aqui, o transplante é usado como transplante nuclear.

Síntese bacteriana de cromossomos

Em 2008, o grupo de Venter descreveu a produção de um genoma sintético, uma cópia da sequência G37 de M. genitalium L43967, por meio de uma estratégia hierárquica:

• Síntese → 1kbp: A sequência do genoma foi sintetizada por Blue Heron em 1.078 cassetes de 1080bp com sobreposição de 80bp e locais de restrição NotI (cortador ineficiente, porém pouco frequente).
• Ligação → 10kbp: 109 grupos de uma série de 10 cassetes consecutivas foram ligados e clonados em E. coli em um plasmídeo e a permutação correta foi verificada por sequenciação.
• PCR Multiplex → 100kbp: 11 Grupos de uma série de 10 conjuntos consecutivos de 10kbp (cultivados em leveduras) foram unidos por PCR multiplex, usando um par de primers para cada conjunto de 10kbp.
• Isolamento e recombinação → os conjuntos secundários foram isolados, unidos e transformados em esferoplastos de levedura sem uma sequência vetorial (presente no conjunto 811-900).

O genoma deste resultado de 2008, M. genitalium JCVI-1.0, é publicado no GenBank como CP001621.1. Não deve ser confundido com os organismos sintéticos posteriores, rotulados JCVI-syn, baseados em M. mycoides.

Genoma sintético

Em 2010, Venter e seus colegas criaram o Mycoplasma mycoides, a cepa JCVI-syn1.0, com um genoma sintético. Inicialmente, a construção sintética não funcionou; portanto, para identificar o erro - que causou um atraso de 3 meses em todo o projeto -, uma série de construções semi-sintéticas foi criada. A causa da falha foi uma mutação de desvio de quadro único no DnaA, um fator de iniciação da replicação.

O objetivo de construir uma célula com um genoma sintético era testar a metodologia, como um passo para criar genomas modificados no futuro. O uso de um genoma natural como modelo minimizou as fontes potenciais de falha. Várias diferenças estão presentes no Mycoplasma mycoides JCVI-syn1.0 em relação ao genoma de referência, notadamente um transposon IS1 de E.coli IS1 (uma infecção do estágio de 10kb) e uma duplicação de 85bp, além de elementos necessários à propagação em leveduras e resíduos de sites de restrição.

Houve controvérsia sobre se o JCVI-syn1.0 é um verdadeiro organismo sintético. Enquanto o genoma foi sintetizado quimicamente em muitas partes, ele foi construído para corresponder ao genoma parental de perto e transplantado para o citoplasma de uma célula natural. O DNA por si só não pode criar uma célula viável: proteínas e RNAs são necessários para a leitura do DNA e membranas lipídicas são necessárias para compartimentar o DNA e o citoplasma. No JCVI-syn1.0, as duas espécies usadas como doador e receptor são do mesmo gênero, reduzindo possíveis problemas de incompatibilidade entre as proteínas no citoplasma do hospedeiro e o novo genoma. Paul Keim (geneticista molecular da Universidade do Norte do Arizona em Flagstaff) observou que "existem grandes desafios pela frente antes que os engenheiros genéticos possam misturar, combinar e projetar completamente o genoma de um organismo a partir do zero".

Marcas d'água

Marca d'água oculta em um chip semicondutor de 1976, agindo como uma assinatura de seus criadores. De maneira análoga, JC Venter e sua equipe adicionaram marcas d'água usando códons de terminação para assinar sua criação.

Um recurso muito divulgado do JCVI-syn1.0 é a presença de sequências de marcas d'água. As 4 marcas d'água (mostradas na Figura S1 no material suplementar do artigo) são mensagens codificadas escritas no DNA, com comprimento de 1246, 1081, 1109 e 1222 pares de bases, respectivamente. Essas mensagens não usavam o código genético padrão, no qual sequências de 3 bases de DNA codificam aminoácidos, mas um novo código inventado para esse fim, que os leitores eram desafiados a resolver. O conteúdo das marcas d'água é o seguinte:

1. Marca d'água 1: um script HTML que lê em um navegador como texto parabenizando o decodificador e instruções sobre como enviar um email aos autores para comprovar a decodificação.
2. Marca d'água 2: uma lista de autores e uma citação de James Joyce: "Viver, errar, cair, triunfar, recriar a vida fora da vida".
3. Marca d'água 3: mais autores e uma citação de Robert Oppenheimer (sem créditos): "Veja as coisas não como são, mas como podem ser".
4. Marca d'água 4: mais autores e uma citação de Richard Feynman: "O que não posso construir, não consigo entender".

JCVI-syn3.0

O gene funciona no genoma mínimo do organismo sintético, Syn 3.

Em 2016, o Venter Institute usou genes do JCVI-syn1.0 para sintetizar um genoma menor chamado JCVI-syn3.0, que contém 531.560 pares de bases e 473 genes. Em 1996, depois de comparar M. genitalium com outra pequena bactéria Haemophilus influenza, Arcady Mushegian e Eugene Koonin propuseram que houvesse um conjunto comum de 256 genes que poderia ser um conjunto mínimo de genes necessários para a viabilidade. Nesse novo organismo, o número de genes só pode ser reduzido para 473, 149 dos quais têm funções completamente desconhecidas.

O JCVI-syn3A é um organismo sintético que contém sete genes principais que o ajudam a se dividir como as células normais. Foi construído a partir da célula sintética JCVI-syn3.0 existente. Enquanto JCVI-syn3.0 poderia construir proteínas e replicar seu DNA sem problemas, a célula minimalista não poderia se dividir em esferas uniformes. Em vez disso, ele se dividiu ao acaso, produzindo células-filhas de muitas formas e tamanhos diferentes. Os cientistas decidiram consertar esse problema adicionando genes de volta à célula despojada. Após anos de trabalho, os cientistas produziram JCVI-syn3A, que contém um total de 492 genes. Sete desses genes são essenciais para a divisão celular normal.

Preocupações e controvérsias

Recepção

Em 6 de outubro de 2007, Craig Venter anunciou em entrevista ao jornal britânico The Guardian que a mesma equipe havia sintetizado quimicamente uma versão modificada do cromossomo único do Mycoplasma genitalium. O genoma sintetizado ainda não havia sido transplantado para uma célula em funcionamento. No dia seguinte, o grupo de bioética canadense ETC Group divulgou uma declaração através de seu representante, Pat Mooney, dizendo que a "criação" de Venter era "um chassi no qual você poderia construir quase tudo. Poderia ser uma contribuição para a humanidade, como novas drogas, ou uma enorme ameaça para a humanidade, como armas biológicas". Venter comentou "Estamos lidando com grandes idéias. Estamos tentando criar um novo sistema de valores para a vida. Ao lidar com essa escala, você não pode esperar que todos sejam felizes."

Em 21 de maio de 2010, a Science informou que o grupo Venter sintetizou com sucesso o genoma da bactéria Mycoplasma mycoides a partir de um registro de computador e transplantou o genoma sintetizado para a célula existente de uma bactéria Mycoplasma capricolum que teve seu DNA removido. A bactéria "sintética" era viável, ou seja, capaz de se replicar. Venter a descreveu como "a primeira espécie ... a ter seus pais como um computador".

A criação de uma nova bactéria sintética, JCVI-3.0, foi anunciada na Science em 25 de março de 2016. Possui apenas 473 genes. Venter o chamou de "o primeiro organismo projetista da história" e argumentou que o fato de 149 dos genes necessários terem funções desconhecidas significa que "todo o campo da biologia está perdendo um terço do que é essencial para a vida".

Cobertura da imprensa

O projeto recebeu uma grande quantidade de cobertura da imprensa devido ao talento de Venter, na medida em que Jay Keasling, um biólogo sintético pioneiro e fundador da Amyris, comentou que "a única regulamentação de que precisamos é da boca do meu colega".

Utilitário

Venter argumentou que as bactérias sintéticas são um passo para a criação de organismos para fabricar hidrogênio e biocombustíveis, e também para absorver dióxido de carbono e outros gases de efeito estufa. George M. Church, outro pioneiro em biologia sintética, expressou a visão contrastante de que a criação de um genoma totalmente sintético não é necessária, uma vez que a E. coli cresce mais eficientemente que a M. genitalium, mesmo com todo o seu DNA extra; ele comentou que genes sintéticos foram incorporados ao E.coli para executar algumas das tarefas acima.

Propriedade intelectual

O J. Craig Venter Institute registrou patentes para o genoma do laboratório Mycoplasma (o "genoma bacteriano mínimo") nos EUA e internacionalmente em 2006. O grupo ETC, um grupo canadense de bioética, protestou com o argumento de que a patente tinha escopo muito amplo.

Projetos similares

De 2002 a 2010, uma equipe da Academia Húngara de Ciências criou uma variedade de Escherichia coli chamada MDS42, que agora é vendida pela Scarab Genomics de Madison, WI, sob o nome de "Clean Genome". E.coli ", onde 15% do genoma da cepa parental (E. coli K-12 MG1655) foram removidos para auxiliar na eficiência da biologia molecular, removendo elementos de inserção, pseudogenes e fagos, resultando em melhor manutenção de genes tóxicos codificados por plasmídeo, que geralmente são inativados por transposons. Máquinas de bioquímica e replicação não foram alteradas.

A – Fontes primárias

B – Imprensa popular

Ligações externas

• J. Craig Venter Institute: Grupos de Pesquisa